Методы культивирования анаэробов

Выведение облигатно анаэробных микроорганизмов существенно отличается от изучения других типов бактерий, так как если в атмосфере содержание О2 будет превышать 0,1%, то они погибнут. Поэтому при изучении этих микроорганизмов необходимо соблюдать определённые правила, иначе их нарушение может привезти к искажению результата или вовсе гибели анаэробов. Первым, кто смог удачно произвести выделение анаэробов, стал Л.Пастер на исходе XIX века. С того времени учёные применяли огромное количество способов и методов для выведения данных микроорганизмов, от многих пришлось отказаться в виду их сложности или не практичности, но на замену им пришли более совершенные современные методы.

Специфика выведения анаэробов.

Для правильного культивирования анаэробов, необходима специально подготовленная среда, отвечающая определённым требованиям:

1. Удовлетворять пищевым требованиям анаэробов и способствовать их стабильному и здоровому росту (пептоны - 2%,гемин и др.)
   
2. В случаях необходимости, содержать в себе добавки для стимуляции развития (например, лошадиная сыворотка (до 10%).
   
3. Наличие низкого окислительно-восстановительного потенциала. Этого можно достичь, добавив в среду редуцирующий элемент.
   
4. Наличие селективных добавок. В большинстве случаев используется аминогликозидный ряд антибиотиков.

Кроме того, для удачного культивирования анаэробных бактерий необходимо следить за тем, чтобы содержание кислорода не превышало 0,1%. Для этого используются анаэробные камеры, микроанаэростаты или анаэробные пакеты.

Анаэробные камеры – прозрачная, герметичная станция, может быть как перчаточной, так и безперчаточной. Необходимые условия создаются в ней посредством возникновения вакуума и добавления двухкомпонентного ( N2 +H2) или трёхкомпонентного ( N2+CO2+H2) анаэробного газа. Камера оснащена специальными шлюзами, для лёгкого введения необходимых образцов и материалов, термостатом, контролирующим влажность, приборы для регуляции концентрации кислорода и его вывода из рабочей зоны. Так как данный агрегат обеспечивает самое высокое качество культивирования среди своих аналогов, он является довольно дорогим удовольствием, в основном его могут позволить основные исследовательские лаборатории или же частные центры изучения. Кроме этого его удобство также обусловлено внушающей вместительностью до двухсот чашек Петри.

Микроанаэростат – бочкообразная, герметично закрываемая металлическая или пластмассовая ёмкость объёмом от 2 до 7 литров. Создание необходимых условий в агрегате происходит двумя способами:

1. вакуумозамещение – создаётся вакуум и запускается анаэробный газ.
   
2. Химическое связывание кислорода – с использованием газогенерирующей системы, генерирующие H2 и СО2. H2 – поглощает лишний кислород при появлении воды в системе, СО2 – является стимулятором роста для изучаемых микроорганизмов.
   

Контроль за бескислородной средой в микроанаэростатах контролируется специальной полоской-индикатором, которая при удалении кислорода из рабочей среды – обесцвечивается.      

Основным недостатком данного агрегата является то, что исследования проводятся в кислородосодержащей среде и только потом помещаются в микроанаэростат, из-за чего качество результатов уступает анаэробной камере. Вместимость его до двенадцати чашек Петри и в основном используется в небольших лабораториях.   

Анаэробный пакет – это прозрачный пластиковый пакет с герметичным закрыванием и объёмом до двух чашек Петри. Создание анаэробных условий создаётся путём взаимодействия реакционной безводной системы с кислородом. Пакет, как и в случае с микроанаэростатом, оснащён полоской-индикатором. Анаэробные пакеты являются наиболее практичным способом, удобным в экстренных и полевых условиях, и при этом показывают удовлетворительные по качеству результаты, хоть и ниже, чем у вышеназванных агрегатов.

Приведённые методы являются основными в микробиологических исследованиях на сегодняшний день, но в истории диагностики анаэробов использовалось немало других, не менее интересных:

• Метод Вейнберга. Изучаемый материал разводили в специальном изотоническом растворе. Далее помещали посевы в пробирки с охлаждённым до 450С сахарным агаром ( или же использовалась среда Вильсон –Блера).
• Метод Вильяля –Вейона. Материал разводили в расплавленной среде Вильсона –Блера, заранее охлаждённую до 450С , заливали в капилляры пастеровских пипеток и запаивали их концы. Далее в течение трёх суток хранили в цилиндре из стекла с выложенной на дне ватой. После чего колонии вырастали и изолировались путём надломления капилляра выше нахождения колонии и извлекались с помощью петли.
• Метод Аристовского или химический метод. Исследуемые микроорганизмы в чашках Петри помещали в специальные стеклянные ёмкости, у которых были притёрты края крышки (эксикатор). На дно ёмкостей помещали химический поглотитель кислорода (например, пирогаллол).
• Метод Форнера или биологический метод. В чашке Петри создаётся специальная среда, состоящая из 5% агара и 1-2% глюкозы и разделяется желобом на две половинки, где с одной стороны исследуемый материал, а с другой – культура, активно поглощающих кислород, аэробов и проводили герметизацию. Аэробы активно поглощали кислород в герметичной среде, что давало возможность роста для анаэробов.